1 . 产 品 介 绍

Dextrin Beads 6FF是一种纯化带有麦芽糖结合蛋白(MBP)标签蛋白的亲和层析介质，具体性能见表1。MBP可促进连接蛋白的正确折  叠，增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。Dextrin Beads 6FF可以一步纯化MBP融合蛋白，结合的融合蛋白可

以用10mM麦芽糖进行温和洗脱，保护了标签蛋白的活性。如果要去除MBP融合部分可用位点特异性蛋白酶切除。

2 . 纯 化 流 程

2.1 缓冲液的准备

所用水和缓冲液在使用之前建议用0.22μm或0.45μm滤膜过滤。

平衡/洗杂液：20 mM Tris-HCl,200 mM NaCl,1mM EDTA,pH7.4

洗脱液：20mM Tris-HCl,1mM EDTA,10mM麦芽糖，pH7.4

注意：平衡液和洗脱液中可加入1mM DTT或10mMβ-巯基乙醇

2.2 样品准备

样品在上样前建议离心或用0.22μm或0.45μm滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。

2.3 Dextrin Beads 6FF装填

2.3.1重力柱的装填

1)取合适规格的重力层析柱，装入下垫片，加入适量纯水润洗柱管和垫片，关闭下出口。

2)将Dextrin Beads 6FF混合均匀，用枪头吸取适量浆液加入至重力柱中(介质实际体积占悬液的一半),打开下出口流干保护液。

3)加入适量纯水冲洗介质，待柱管中液体重力流干后，关闭下出口。

4)装入润洗后的上垫片，确保垫片与填料之前没有空隙，且保持水平。

5)装填好的重力柱可以直接加入平衡液进行平衡，暂不使用时则加入保护液，2-8℃保存。

2.3.2 中压层析柱的装填

Dextrin Beads 6FF被广泛应用于工业纯化，因此，涉及到各种中压色谱层析柱的填装，下面介绍填装层析柱的方法。

装柱前根据层析柱直径计算柱子底面积，根据所需装柱高度计算所需介质体积，公式如下：

V =1.15m²h

V:所需介质体积ml

1.15:压缩系数

r:柱管半径cm

h · 装填高度cm

注意： 所取悬液体积应为介质体积的两倍，因为介质体积只占悬液总体积的一半，另一半为保护液。

1)用去离子水冲洗层析柱底筛板与接头，确保柱底筛板上无气泡，关闭柱底出口，并在柱底部留出1-2 cm 的去离子水。 2)将介质悬浮起来，小心的将浆液连续地倒入层析柱中。用玻璃棒沿着柱壁倒入浆液可减少气泡的产生。

3)如果使用储液器，应立即在层析柱和储液器中加满水，将进样分配器放置于浆液表面，连接至泵上，避免在分配器或进样管中产生气泡。 4)打开层析柱底部出口，开启泵，使其在设定的流速下进行。最初应让缓冲液缓慢流过层析柱，然后缓慢增加至最终流速，这样可避免液 压对所形成柱床的冲击，也可以避免柱床形成的不均匀。如果达不到推荐的压力或流速，可以用你所使用泵的最大流速，这样也可以得到  一个很好的装填效果。(注意：在随后的色谱程序中，不要超过最大装柱流速的75%)当柱床高度稳定后，在最后的装柱流速下至少再上3

倍柱床体积的去离子水。标上柱床高度。

5)关闭泵，关闭层析柱出口。

6)如果使用储液器，去除储液器，将分配器置于层析柱中。

7)将分配器推向柱子至标记的柱床高度处。允许装柱液进入分配器，锁紧分配器接头。

8)将装填好的层析柱连接至泵或色谱系统中，开始平衡。如果需要可以重新调整分配器。

2.4样品纯化

2.4.1 孵育法纯化

1)根据纯化的样品量，取适量Dextrin  Beads   6FF加入离心管中，1000 rpm 离 心 1min,   吸弃上清；也可加入重力柱中，流干保护液。 2)向离心管中加入5倍介质体积的平衡液清洗介质，1000 rpm 离 心 1min, 吸弃上清；如使用重力柱，则直接在重力柱中清洗，直接重 力流干平衡液；重复两次以上。

3)加入样品，封闭离心管或重力柱管，4℃振荡孵育2-4 h 或者37℃孵育30 min-2 h。

4)孵育结束后，1000 rpm 离 心 1min, 吸弃上清，或过滤收集介质，上清保留作为流穿，用于电泳鉴定。

5)用5倍介质体积的洗杂液清洗介质，1000 rpm 离 心 1min 或重力柱管过滤，去除上清(注意不要吸到介质),重复3-5次，中间建议更 换新离心管。

6)加入3-5倍柱体积的洗脱液进行洗脱，室温孵育5min,1000   rpm离 心 1min 或重力柱管收集洗脱液，可重复2-3次。

2.4.2重力柱法纯化

1)将装填好的Dextrin  Beads  6FF 重力柱用5倍柱体积平衡液进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲液体系下，重复2-3次。 2)将样品加到平衡好的重力柱中，样品保留时间至少2min, 保证样品和介质充分接触，收集流出液，可以反复上样增加结合效率。  3)用10-15倍柱体积的洗杂液进行洗杂，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。

4)使用5-10倍柱体积的洗脱液洗脱，分段收集，每一个柱体积收集一管，分别检测，既可以保证所有结合的目的蛋白被洗脱，又可以得 到高纯度和高浓度的蛋白。

2.4.3中压层析柱法纯化

Dextrin  Beads  6FF 装填好后，可以用各种常规的中低压色谱系统。

1)将泵管道中注满去离子水。去掉上塞子，将层析柱连接至色谱系统中，打开下出口，将预装柱接到色谱系统中，并旋紧。 2)用3-5倍柱体积的去离子水冲洗出储存缓冲液。

3)使用至少5倍柱床体积的平衡液平衡色谱柱。

4)利用泵或样品环上样。注：样品的粘度增加使得即使上样体积很少，也会导致层析柱很大的反压。上样量不要超过柱子的结合能力。大 量的样品体积也可能造成很大的反压，使得进样器更难使用。

5)用洗杂液冲洗柱子，直到紫外吸收达到一个稳定的基线(一般至少10-15个柱体积)。

6)使用5-10倍柱体积的洗脱液洗脱，收集洗脱液，即目的蛋白组分。

介质洗脱结束后，用平衡液冲洗5-10柱体积，然后用纯水冲洗5-10个柱体积，再用20%乙醇冲洗2个柱体积，置于2-8℃保存。

2.5  SDS-PAGE检测

将使用纯化产品得到的样品(包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分)以及原始样品使用SDS-PAGE  检测纯化效果。

3. 填料清洗

Dextrin Beads 6FF 纯化产品可以重复使用而无需再生，但随着非特异性结合的蛋白的增多和蛋白的聚集，往往造成流速和结合载量都下 降，这时可按照下面方法对填料进行清洗。

1)3倍柱体积的去离子水；

2)3倍柱体积的0.1% SDS 或0.1 M  NaOH溶液；

3)3倍柱体积去离子水，20%乙醇2-8℃保存。

4.问题及解决方案

5.订购信息及相关产品